前言

2023年9月，大连医科大学的李明团队和中国科学院大连化学物理研究所的闫竞宇团队发表在国际权威期刊《Gut Microbes》上发表了一项最新研究成果[1]。该研究揭示了妊娠期糖尿病（GDM）母亲与健康母亲乳汁中母乳低聚糖（HMOs）的组成差异及其对婴儿的肠道微生物结构和代谢物的影响；并通过构建GDM小鼠模型探究其子代肠道菌群变化和免疫耐受机制，为GDM新生儿肠道菌群和免疫耐受的发展提供了新的思路。健合集团合生元营养与护理研究院（BINC）母婴营养与护理研究基金为本研究提供支持。

背景

妊娠期糖尿病(GDM)是在妊娠期间首次诊断的糖耐量受损。GDM是一个日益严重的公共卫生问题，对母亲和儿童均有影响，可能造成先兆子痫、孕期2型糖尿病、新生儿低血糖和早期儿童过敏（如湿疹、食物过敏和哮喘）等疾病。因此本研究通过对比中国健康母亲和GDM母亲的母乳低聚糖（HMO）组成和所喂养婴儿肠道微生物群的差异，评估GDM母亲母乳中HMO变化与婴儿肠道微生物群定植的可能相关性。利用GDM小鼠模型，进一步研究母体GDM诱导乳寡糖改变对子代小鼠肠道微生态及免疫耐受发育的影响及相关机制，为新生儿过敏性疾病的预防提供新的方向。

主要结论

1. 妊娠期糖尿病（GDM）母亲初乳中总体和特定母乳低聚糖（HMOs）水平较健康母亲显著降低，延缓了乳酸杆菌和双歧杆菌在婴儿肠道定殖，导致不同的肠道菌群结构和代谢物组成。

2. GDM模型小鼠乳汁中3'-唾液酸乳糖（3?-SL）的降低减少罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌在新生小鼠肠道的定殖，阻碍RORγt+ Treg介导的免疫耐受的发育。

3. 3'-唾液酸乳糖（3?-SL）、罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌促进Treg增殖和RORγt表达，降低卵清蛋白诱导的过敏反应，该组合的代谢产物促进RORγt+ Treg的体外分化。

4. 为儿童早期补充同时含有HMOs和双歧杆菌/乳酸杆菌的微生态制剂用于维持微生态平衡和预防过敏性疾病提供理论依据。

研究方法

本研究通过收集中国健康母亲和GDM母亲在不同哺乳期的母乳样本及其母乳喂养的婴儿的粪便样本，比较两组之间母亲HMOs和婴儿肠道微生物群的差异，并评估GDM母亲母乳中HMOs变化与母乳喂养的婴儿肠道微生物群定植的可能相关性。随后，利用GDM小鼠模型，进一步研究母源性GDM诱导的乳寡糖改变对子代小鼠肠道微生态及RORγt+ Treg细胞介导的免疫耐受发生发展的影响，为预防新生儿过敏性疾病提供新的方向。

研究结果

 1. 妊娠期糖尿病（GDM）中国母亲的HMO谱发生改变

GDM中国母亲的乳汁中葡萄糖的平均水平高于健康母亲（图1a），尤其是初乳。而GDM母亲的初乳中乳糖和母乳低聚糖（HMOs）的含量显著低于健康母亲。上述现象在第42天采集的母乳样品中发生了逆转，并且在第90天的两组母乳样品中多种寡糖的水平相当（图1b），结果表明GDM母亲的HMO谱发生了改变。

图1 中国健康产妇与GDM产妇不同哺乳期HMOs水平的比较

2. 不同母亲喂养的婴儿在哺乳期的粪便HMO水平

检测婴儿粪便样本中剩余的HMO，研究健康母亲和GDM母亲母乳对婴儿肠道微生物群利用HMO的影响（图2a）。第6天GDM母亲母乳喂养婴儿的粪便中，总HMO和单体HMO（如LNT、LNFP-II、DSLNT和3?-SLNFP-II和6?-SLNFP-VI等）的含量均显著低于对照组（图2b）。到第42天，GDM母亲母乳中总HMO和单体HMO增加，但两组婴儿的粪便中总HMO或单体HMO类别的含量没有显著差异。GDM母亲的婴儿粪便中3?--FL、LNFP-II、LNFP-III的含量甚至低于对照组，说明GDM母亲的婴儿对HMO的利用有所增加。

图2 不同哺乳期健康母亲与GDM母亲

 喂养婴儿粪便HMOs的比较

3. GDM母亲喂养婴儿的独特肠道微生物结构及其与母亲HMOs的相关性

进一步评估了GDM母亲乳汁中HMO模式改变对哺乳期间母乳喂养婴儿肠道微生物组成的影响。与对照组相对稳定的菌群组成相比，GDM婴儿的肠道细菌群落结构在哺乳期出现了显著波动（图3b），在对照组婴儿中，乳杆菌属和双歧杆菌属，在第6天和第42天就分别成为优势菌属。相反，在GDM婴儿中，这些细菌在第42天和第90天成为优势菌群。结果表明GDM导致婴儿乳杆菌属和双歧杆菌属的定植和优势生长延迟。

图3 GDM母亲喂养的婴儿肠道菌群结构变化

 及其与母亲HMOs的相关性

图4 健康母亲和GDM母亲婴儿粪便菌群的

 宏基因组学分析及比较

4. GDM新生小鼠肠道菌群的定植与母乳低聚糖和肠道菌群的改变有关

为了研究GDM母亲乳中低聚糖的改变对新生儿肠道微生物的影响，我们建立了GDM小鼠模型（图5a）。选取小鼠泌乳中后期的第12天和第28天两个时间点进行分析。泌乳第12天采集的GDM小鼠乳中总HMO水平显著低于对照组，其中主要是3′-SL、SA和6′-SLN水平降低。到第28天哺乳后期，两组的总HMO水平相当，但GDM小鼠乳汁中3′SL含量仍显著低于对照组。

进一步研究了HMO的改变是否影响其后代早期微生物定植和免疫发育。对照组新生小鼠肠道菌群以丰富的乳酸菌、双歧杆菌和异丙杆菌为特征，而GDM子代的肠道微生物结构与对照组子代明显不同（图5e）。在GDM子代的肠道中，罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌等乳杆菌的相对丰度降低。

5. GDM子代Treg细胞的发育

肠道菌群的早期定植影响宿主免疫系统的发育，特别是肠粘膜免疫细胞。通过采用流式细胞术分析发现泌乳后期，GDM子代新生小鼠外周血总淋巴细胞百分比和Treg细胞百分比显著低于对照组子代（图5）。结果表明，GDM子代肠道菌群的改变影响了Treg细胞的发育。

图5. GDM母鼠乳中低聚糖的变化及其后代肠道菌群

 和Treg细胞水平的变化

6. 卵清蛋白（OVA）诱导食物过敏（FA）的GDM子代肠道乳酸菌数量显著减少

通过建立FA模型研究GDM子代肠道菌群和免疫状态改变对免疫耐受发育的影响（图6a）。经造模后，GDM小鼠的血清IL- 4浓度显著高于对照组小鼠(p = 0.0115)。相反，GDM后代的INF-γ浓度显著低于对照组子代(p = 0.0478)，表明GDM后代的免疫耐受发育受到破坏。经过FA模型建模处理后，对照组和GDM组子代的肠道细菌种类均增加，并且菌群结构发生改变（图6d）。在FA模型中，GDM组子代的乳酸菌和双歧杆菌的丰度显著减少（图6d），尤其是罗伊氏乳杆菌和约翰逊乳杆菌比对照组子代明显减少（图6f），说明了乳酸杆菌属在调节新生小鼠免疫耐受中发挥了重要作用。

图6 OVA诱导FA对GDM子代免疫应答

和肠道乳酸杆菌丰度的影响

7. 在GDM子代中添加约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和3?-SL可提高肠道Treg细胞的比例

为了进一步研究GDM母鼠乳汁中低聚糖的改变对子代免疫耐受的影响，我们在哺乳期连续10天给GDM新生小鼠灌胃罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌或3?-SL（图7a）。联合使用添加罗伊氏乳杆菌、约翰氏乳杆菌和3?-SL的子代脾脏中Treg（CD4+FoxP3+）细胞的百分比显著高于对照组（图7d）。补充该组合可促进新生小鼠肠道RORγt+细胞的发育，这对肠道黏膜免疫耐受的发展至关重要。

8. 罗伊氏乳杆菌和约翰氏乳杆菌的代谢产物促进小鼠RORγt+ Treg细胞的体外分化

通过体外培养实验发现，约氏乳杆菌的代谢产物、罗伊氏乳杆菌的裂解物与3?-SL刺激后Treg细胞数量显著增加，尤其是乳酸杆菌对脾脏淋巴细胞RORγt+ Treg细胞分化的刺激作用明显（图7）。通过进一步的研究，发现该组合通过对toll样受体、MAPK、p53和nod样受体信号通路的多重调控作用刺激小鼠RORγt+ Treg细胞的分化。

图7 罗伊氏乳杆菌、约翰氏乳杆菌和3'-SL可促进 

小鼠RORγt+ Treg细胞的发育

总结

本研究揭示了GDM母亲乳汁中HMOs的改变，并评估了这种改变对新生儿肠道微生物群发育和RORγt+ Treg细胞介导的免疫耐受的可能影响。本研究结果可能为人类群体的研究提供了理论基础，特别为儿童早期补充同时含有HMOs和双歧杆菌/乳酸杆菌的微生态制剂以维持微生态平衡和预防过敏性疾病提供指导。

参考文献

[1] Li X, Ning X, Rui B, Wang Y, Lei Z, Yu D, Liu F, Deng Y, Yuan J, Li W, Yan J, Li M. Alterations of milk oligosaccharides in mothers with gestational diabetes mellitus impede colonization of beneficial bacteria and development of RORγt+ Treg cell-mediated immune tolerance in neonates. Gut Microbes. 2023 Dec;15(2):2256749. doi: 10.1080/19490976.2023.2256749.